解纖維梭菌(Clostridium cellulolyticum)及其他纖維素降解梭菌能夠通過整合生物加工技術的策略實現木質纖維素基生物燃料及化學品的合成。日前，中國科學院青島生物能源與過程研究所代謝物組學團隊基于前期開發和優化的一系列基因操作工具(Cui GZ, et al, J Microbiol Methods, 2012, 89: 201-8.; Mohr G, Hong W, et al, PloS One 2013, 8:e69032; Cui GZ, Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 313-23.)的基礎上，進一步開發了新型梭菌可控基因操作系統，有力推動了梭菌代謝工程研究，促進了木質纖維素生物轉化的工業化進程。相關成果于3月4日在線發表在Biotechnology for Biofuels (Zhang J, et al, 2015, 8:36)。 

　　國內外研究學者已經針對梭菌開發出不同的遺傳改造工具，包括用于基因敲除的同源重組及二類內含子打靶方法，用于外源基因表達的基因組整合及質粒表達方法等。單到目前為止仍較缺乏實現基因可控誘導表達的高效、嚴謹工具。 

　　博士生張杰、副研究員劉亞君等構建了以阿拉伯糖為特異性誘導劑的高效可控誘導表達系統ARAi，該系統包括具有不依賴于氧氣的熒光蛋白報告基因的誘導表達平臺(圖1A)，基于毒力基因MazF的靈敏的反篩標記以及可用于基因精準打靶的誘導型ClosTron系統。ARAi所具有的阿拉伯糖誘導啟動子來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，在有誘導劑存在條件下，其基因表達水平能上調800倍以上(圖1B)，這是已知梭菌誘導表達系統中的最高效率。此外，該研究構建的誘導型ClosTron系統的脫靶率從原先的100%下降到0，徹底解決了ClosTron的脫靶問題，實現了精準的基因敲除。 

　　基于對中溫及嗜熱梭菌遺傳改造技術研究的成果和經驗，劉亞君副研究員于3月3日在Biotechnology Journal在線發表相關綜述文章(Liu YJ, et al, 2015. doi:10.1002/biot.201400716)，對基于二類內含子的targetron基因打靶技術及其在代謝工程中的應用進行了系統闡述(圖2)，同時展示了該團隊近年來在梭菌改造領域的最新進展。 

　　上述研究由崔球研究員主持完成，獲得了科技部973、國家自然科學基金、青島市科技發展基金等的支持。 

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　　圖1. ARAi系統在解纖維梭菌中的誘導作用。 

　　A, 不依賴于氧氣的綠色熒光蛋白在解纖維梭菌中的誘導表達。1,2，無誘導劑；3,4，添加阿拉伯糖作為誘導劑；1,3，細胞形態；2,4，熒光檢測。B, 以X-gluc為底物檢測GusA蛋白在解纖維梭菌中的誘導表達。1-3，不添加細胞裂解液或不添加誘導劑的陰性對照；4-6，添加0.1、1或10 g/L阿拉伯糖進行誘導表達。C, 以MUG為底物檢測GusA蛋白在解纖維梭菌中的誘導表達。在有誘導劑存在條件下，基因表達水平可上調超過800倍。 

　　圖2. Targetron結構及其歸巢機制示意圖。 

　　P，啟動子；T，終止子；RT，反轉錄酶；RNP，核糖核蛋白體；E1，E2，DNA靶位點的5’端及3’端外顯子；淺藍色短線表示intron RNA與DNA靶位點的識別及相互作用；桔色短線表示反轉錄酶與靶位點的識別及相互作用。 

　　原文鏈接： 

　　http://www.biotechnologyforbiofuels.com/content/8/1/36 

　　Zhang J, Liu Y-J, Cui G-Z, Cui Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum [J]. Biotechnology for biofuels, 2015, 8: 36.  

　　http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/biot.201400716/full 

　　    Liu Y J, Zhang J, Cui G Z, Cui Q. Current progress of targetron technology: Development, improvement and application in metabolic engineering [J]. Biotechnology Journal, 2015, 10.1002/biot.201400716