微生物組（Microbiome）是微生物在自然界中的存在形式，它們無處不在、無所不能，與我們每個人乃至海洋、土壤、大氣的健康都息息相關。在微生物組的內部，不同種類的微生物之間存在著復雜、精妙的相互作用與影響，這一跨物種的細胞間代謝互作網絡是群落功能和進化的基礎。然而由于自然界中絕大部分微生物尚難以培養，而且細胞在純培養狀態往往無法體現其“原位”功能，因此“如何原位考察細胞間代謝互作”一直是微生物組方法學研究的重點與難點之一。近日，中科院青島能源所與牛津大學合作發明了“反向拉曼標記技術”，可在單細胞水平上示蹤微生物群落中細胞代謝互作，為微生物組原位功能研究提供了新思路與新平臺。該工作近期發表于Analytical Chemistry。

　　單細胞拉曼成像與活細胞穩定同位素標記相結合的技術，能分辨群落內代謝特定底物的細胞，從而重建“食物鏈”的時空特征。然而自然界中的底物種類幾近無限，許多人們感興趣的底物無法或難以用穩定同位素標記，這大大限制了該技術的應用。針對上述瓶頸，中科院青島能源所單細胞中心王允帶領的研究小組打破了傳統拉曼標記策略的思維定勢，先使用13C標記的廣譜碳源（如葡萄糖等）把群落中所有細胞都“喂飽”，再將碳源切換為未經標記的目標底物，然后通過觀測單細胞拉曼光譜中目標底物代謝并替換細胞中13C標記化合物的過程，也就是測量13C拉曼峰反向漂移到12C位置的動態特征，從而分辨群落中特異性地代謝目標底物的細胞。同時，通過重水飼喂，觀測2180 cm-1附近C-D峰的出現，以同時監測細胞的綜合代謝活性。結合上述兩種特性，可成像與重建細胞間的相互作用及底物傳遞過程（圖1）。

　　在此基礎上，研究人員構建了由不動桿菌（Acinetobacter spp.）與大腸桿菌（E. coli）組成的模擬菌群，它們是人體、醫院和自然界中均常見的機會致病菌，且其耐藥性日益嚴重，已引起臨床和微生物學者的關注。反向拉曼標記技術結合“碳源-重水”雙標記實驗發現，在檸檬酸作為唯一碳源的共培養體系中，不動桿菌可快速利用檸檬酸，并展現了較高的綜合代謝活性。大腸桿菌“單身”時完全不能利用檸檬酸，但在與不動桿菌“同居”時卻表現出了一定的綜合代謝活性。代謝物組分析表明，在雙方“同居”時，不動桿菌代謝檸檬酸的產物苯丙氨酸及腐胺可被大腸桿菌利用，含量雖不足以支撐后者的細胞分裂，但能保持其基礎水平的綜合代謝活性。因此該方法可在單細胞水平上解析與示蹤群落中細胞之間的代謝互作與共生關系。

　　當前微生物組功能分析的主要工具，如元基因組、元轉錄組、元代謝組、穩定性同位素核酸探針（DNA/RNA-SIP）技術以及高通量培養技術等，通常難以揭示原位狀態下群落中的各個成員在代謝功能上的互作關系。因此這一“反向拉曼標記技術”和雙標記策略具備獨特優勢，有望作為一種共性手段與新工具，服務于人體健康、海洋生態、環境修復、生物發酵等廣泛領域的微生物組研究。

　　上述工作由英國牛津大學工程系黃巍和中科院青島能源所單細胞中心徐健聯合主持，獲得了基金委、中科院土壤微生物先導專項和中科院生物高通量檢測分析服務網絡（STS）等項目的支持。　

　　附錄：Wang Y., Song Y., Tao Y., Muhamadali H., Goodacre R., Zhou N.Y., Preston G.M., Xu J.*, Huang W.E.* (2016). Reverse and multiple stable isotope probing to study bacterial metabolism and interactions at the single cell level. Analytical Chemistry, 88: 9443-9450.