辛伐他?。?font face="Times New Roman">Zocor）是土曲霉天然產物洛伐他汀的半合成衍生物，是一種重要的降血脂藥，2015年全球銷售額達到30億美元。辛伐他汀的工業生產工藝可分為三個過程：土曲霉發酵生產洛伐他汀，堿水解洛伐他汀制備monacolin J，化學方法將monacolin J轉化成辛伐他?。▓D1）。針對monacolin J轉化成辛伐他汀，美國研究人員前期開發了基于?；D移酶LovD的生物催化轉化方法，并獲得2012年美國總統綠色化學獎。但monacolin J的制備仍然是使用傳統的堿水解洛伐他汀工藝，工序相對復雜、環境污染較大。因此，開發一種綠色高效的monacolin J生產方法非常重要。包括默克公司在內的研究團隊曾試圖開發可替代的生物轉化方法，但是由于效率較低，都未能應用到實際生產中。近年來，青島能源所微生物代謝工程團隊（mme.qibebt.ac.cn）基于在絲狀真菌遺傳改造方面的研究基礎，與全球最大的洛伐他汀/辛伐他汀原料藥生產企業浙江海正藥業集團進行了深入合作，旨在對海正藥業的洛伐他汀工業生產土曲霉菌株進行代謝工程改造，使之能直接發酵生產monacolin J。

圖1. 辛伐他汀生產工藝及本項目研究方案示意圖

　　 為了遺傳改造工作的順利進行，該團隊開發了一個高效的土曲霉遺傳操作平臺，克隆表征了一系列高效土曲霉啟動子，為遺傳改造提供啟動子元件支持；通過失活非同源重組末端連接途徑使基因打靶效率從5%提高到90%以上，解決了基因打靶低下的問題；又結合尿嘧啶營養缺陷雙向篩選體系和改良的Cre/loxP位點特異性重組系統實現了篩選標簽的循環利用，突破了篩選標簽不足的限制。該平臺為后續的基因工程改造提供了技術平臺支持（Huang X., et al., 2014，Huang X., et al., 2016）。

　　 近期，研究團隊通過體外實驗鑒定了一個能高效水解洛伐他汀生成monacolin J的洛伐他汀水解酶PcEST，其活性遠高于專利報道的洛伐他汀水解酶，是后者的232倍，而氨基酸序列一致性僅為16.8%，這說明PcEST是不受現有知識產權限制的高效洛伐他汀水解酶，為研究成果的實際應用提供了知識產權保障。

　　基于洛伐他汀水解酶PcEST，該團隊對海正藥業的洛伐他汀工業生產土曲霉菌株進行了遺傳改造。利用強啟動子PgpdAT異源表達洛伐他汀水解酶，成功地在不影響他汀化合物總產量的情況下將體內合成的洛伐他汀水解成了monacolin J，水解率達到95%，從而獲得了能直接發酵生產monacolin J的土曲霉細胞工廠。實現了直接利用現有的洛伐他汀發酵工藝和設備，一步發酵直接生產monacolin J ，不再需要洛伐他汀水解過程，簡化了辛伐他汀的生產工藝，有望降低企業的生產成本和污染排放。該工作近日發表于Metabolic Engineering雜志上（Huang X., et al, 2017），并與海正藥業聯合申請了發明專利（201611079430.2）。

　　上述研究獲得國家自然科學基金和海正藥業集團的支持。（文/圖 黃雪年）

圖2. 產monacolin J土曲霉細胞工廠構建

1）Huang X., Liang Y., Yang Y., Lu X.*, Single-step production of the simvastatin precursor monacolin J by engineering of an industrial strain of Aspergillus terreus, Metabolic Engineering, 2017, 42: 109–114.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717617301180

2）Huang X., Chen M., Li J., Lu X.*, Establishing an efficient gene-targeting system in an itaconic acid producing Aspergillus terreus strain, Biotechnology letters, 2016, 38(9):1603-1610.

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10529-016-2143-y

3）Huang X., Lu X., Li J., Cloning, characterization and application of a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter from Aspergillus terreus. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2014, 41(3): 585- 592.

https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs10295-013-1385-0

4) 呂雪峰，黃雪年，楊勇，鄭玲輝，黃雋，滕云，應玲萍，“2-甲基丁酸側鏈水解酶和產莫納克林J的曲霉菌株及其構建方法與應用”，發明專利，申請號：201611079430.2；

5) 呂雪峰，黃雪年，李建軍，陳梅，“一種切除篩選標簽的方法與應用”，發明專利，申請號：2015102756323；

6) 呂雪峰，黃雪年，李建軍，陳梅，“一種提高基因打靶技術在土曲霉中應用效率的方法與應用”，發明專利，申請號：2015102754915；

7）呂雪峰，黃雪年，李建軍，陳梅，“一種具有高效同源重組能力的土曲霉及其構建方法與應用”，發明專利，申請號：2015102752731；