隨著合成生物學與基因編輯技術的發展，在科學研究中需要編輯越來越多的基因，例如為了構建特定功能的菌株需要進行多輪的基因編輯，而且往往需要通過不同基因編輯的組合構建大量菌株進行“試錯”篩選?，F有基因編輯方法需要引入特定篩選標記或者特定抗性的質粒來完成基因編輯，這些篩選標記或者質粒需要在下一輪基因編輯前去除，從而實現無痕編輯或者篩選標記的重復利用。而篩選標記或者質粒的去除效率很難達到100% （即會發生逃逸），因此在去除標記后需要進行單克隆的篩選和確認。這極大地增加了多輪基因編輯的周期，而且需要更多的培養次數、增加了基因組自發突變的風險。

　　針對這個問題，青島能源所咸漠研究員帶領的材料生物合成技術中心基于“剪刀石頭布”策略實現了免篩選標記/質粒消除步驟的多輪基因編輯方法，相關成果近日發表于國際高影響刊物Nucleic Acids Research。本研究構建了三個能夠循環消除的基因編輯輔助質粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石頭-布”順序分別使用這三個質粒實施基因編輯時，可以同時去除上一輪基因編輯中使用的輔助質粒，從而免除了傳統方法中的篩選標記或者質粒消除步驟，極大地提高了多輪編輯的速度（圖1）。質粒消除效率可達到99.99-100%，幾乎不會有逃逸情況。另外該系統還存在雙重檢查機制：如上一輪發生了逃逸的情況，由于質粒間的拮抗作用則不能進行下一輪編輯。本研究在大腸桿菌和肺炎克雷伯氏菌中對該方法進行了測試，快速完成了多輪的敲除、插入、替換等基因編輯操作。

　　利用本方法進行連續多輪基因編輯時，每一輪編輯僅需要進行兩次培養，即一次平板培養和一次單克隆液體培養（圖2），這幾乎是精細基因編輯所需要的最少培養次數。這不僅極大地縮短了基因編輯周期，還減少了基因組隨機突變的可能性，這些優勢在進行大規模多輪基因編輯時尤為明顯。本方法是目前最快最魯棒的多輪基因編輯策略，可與現有其它CRISPR/Cas9編輯優化策略進行聯合使用并且在未來更易于實現自動化，同樣策略也可以用于其它物種的基因編輯。

　　材料生物合成技術中心博士后王紀超、碩士研究生隋新悅為本論文的共同第一作者，趙廣研究員和咸漠研究員為本論文共同通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金委、國防科工局等項目的資助。

　　圖1. 基于“剪刀石頭布”策略的多基因編輯方法示意圖。A. 三個能夠循環消除的基因編輯輔助質粒，在實施基因編輯的同時能消除上一輪的質粒。 B. 相較于傳統方法，本方法不需要單獨的篩選標記或質粒消除步驟。

　　圖2. 基于“剪刀石頭布”策略的多輪基因編輯流程圖。A. “剪刀石頭布”基因編輯輔助質粒構建流程圖。B. 連續多輪基因編輯步驟流程圖。

　　本研究相關質?？蓮牡谌介_放獲?。?span lang="EN-US">MolecularCloud (www.molecularcloud.org)，MC_0101139, MC_0101140，MC_0101141。建議同時獲取MC_0000011以及MC_0000012。

　　原文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkaa1141  

　　Jichao Wang, Xinyue Sui, Yamei Ding, Yingxin Fu, Xinjun Feng, Min Liu, Youming Zhang, Mo Xian, Guang Zhao, A fast and robust iterative genome-editing method based on a Rock-Paper-Scissors strategy, Nucleic Acids Research, 2020, DOI: 10.1093/nar/gkaa1141