細胞色素P450酶是一類含血紅素的單加氧酶，在藥物代謝、異生物質解毒和類固醇生物合成中發揮重要作用，同時因其具有多功能生物氧化催化、合成的應用潛力而備受關注。針對絕大多數天然P450單加氧酶催化功能的實現高度依賴輔酶NAD(P)H和負責電子傳遞的還原伴侶蛋白的關鍵科學問題，青島能源所叢志奇研究員帶領的單碳酶催化研究組成功構建了雙功能小分子（DFSM）協同P450酶催化系統，能夠有效利用過氧化氫作為末端氧化劑，解除P450酶對輔酶體系依賴的同時極大提高P450BM3對苯乙烯、乙苯、和苯甲硫醚等非天然底物的催化活性，為基于P450酶的生物催化劑開發提供了新的思路（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 7628-7633. Very important paper, Highlighted by Chemistry Views）。
最近，單碳酶催化研究組與代謝物組學研究組馮銀剛研究員團隊合作，巧妙地利用羥胺代替過氧化氫，成功制備并解析了蛋白-羥胺-雙功能小分子三元復合物的高分辨率晶體結構，建立了雙功能小分子協同P450活化過氧化氫的預反應態模型，為解析其分子機制提供了結構基礎（圖1）；進而與廈門大學王斌舉教授團隊合作，通過理論計算模擬，進一步闡明了雙功能小分子介入活性中心氫鍵網絡、使過氧化氫以較低能壘的異裂方式被活化，有利于反應活性物種生成，從而大幅提高了P450酶催化活力的反應機理（ACS Catal. 2021, 11, 8774-8785）。
圖1 “雙功能分子-P450-羥胺”三元復合物的晶體結構
近年來，單碳酶催化研究組先后報道了DFSM協同P450酶催化系統高效的過加氧酶（peroxygenase）功能，比如催化氣態烷烴分子的選擇羥化（ACS Catal. 2019, 9, 7350-7355）、木質素單體芳醚的脫甲基化（Catal. Sci. Technol. 2020, 10, 1219-1223. Inside front cover）、以及苯乙烯的高度R-對映選擇性環氧化（Chem. Sci. 2021, 12, 6307-6314. Back cover, highlighted in “hot off the press” in Nat. Prod. Rep. 2021, 38, 1053）。為拓展DFSM協同P450酶系統的催化多功能性，研究人員利用酶化學機制指導的蛋白質工程策略將該系統由過加氧酶轉換為過氧化物酶（peroxidase）模式，開發了DFSM協同P450酶催化系統的過氧化物酶新功能（ACS Catal. 2021, 11, 8449-8455）。
圖2 DFSM促進的P450過加氧酶至過氧化物酶的功能轉換
過氧化物酶是一類重要的氧化還原酶，在生物催化、生物傳感器和生物醫學中具有廣泛的應用。在細胞色素P450酶研究中，與單加氧酶和過加氧酶催化功能相比，對其過氧化物酶活性的研究仍然較少。研究人員基于對DFSM協同P450酶系統中三種可能催化途徑的機制分析，提出了氧化還原敏感殘基的競爭性氧化途徑可能是阻礙該系統過氧化物酶功能的主要原因的假設，進而通過對不同種類氧化還原敏感殘基進行熱點篩選和迭代組合突變，成功開發出DFSM協同P450酶系統的過氧化物酶新功能（圖2），能夠高效催化愈創木酚、2,6-二甲氧基苯酚、鄰苯二胺、對苯二胺的一電子氧化反應，催化性能可媲美或超過大多數天然過氧化物酶。與廈門大學王斌舉教授團隊的模擬計算合作研究表明，DFSM協同P450系統中過氧化物酶活性可能來源于消除氧化還原敏感殘基的競爭性氧化或蛋白質工程后底物的重定位。該研究進一步證明了DFSM協同P450酶催化系統的可塑性和在生物催化領域的應用潛力，為發展基于P450酶的生物催化劑提供了新的見解和策略。
目前上述兩項相關工作均發表于國際催化領域權威雜志ACS Catalysis。廈門大學張璇博士、青島能源所姜誼平博士、廈門大學陳倩倩為論文一的共同第一作者，廈門大學王斌舉教授、青島能源所叢志奇研究員、馮銀剛研究員為共同通訊作者；青島能源所博士研究生馬娜娜和廈門大學房文涵為論文二的共同第一作者，叢志奇研究員、王斌舉教授為共同通訊作者。上述工作得到國家自然科學基金，國家重點研發計劃，青島市創新領軍人才計劃，青島能源所創新基金以及山東省合成生物技術創新中心等的大力支持。
附錄：
1.Zhang, X.+; Jiang, Y. +; Chen, Q. +; Dong, S.; Feng, Y.*; Cong, Z.*; Shaik, S.; Wang, B.* H-Bonding Networks Dictate the Molecular Mechanism of H2O2 Activation by P450. ACS Catalysis 2021, 11, 8774-8785.
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c02068
2.Ma, N. +; Fang, W. +; Liu, C.; Qin, X.; Wang, X.; Jin, L.; Wang, B.*; Cong, Z.* Switching an Artificial P450 Peroxygenase into Peroxidase via Mechanism-Guided Protein Engineering. ACS Catalysis 2021, 11, 8449-8455.
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c02698
