微生物組（又稱菌群）在自然界和人體中無處不在，因此菌群測序在生態健康診斷、生態過程監控、生物資源挖掘、合成生物學研究等領域均具廣闊應用。針對目前菌群測序方法學領域面臨的痛點與難點，中科院青島能源所單細胞中心和中國海洋大學發明了一種高物種分辨率、高靈敏性、可同時鑒定所有原核與真核微生物、不懼樣品降解或污染、低成本的微生物組測序技術(2bRAD-M)。該項成果發表于國際基因組學領域權威期刊Genome Biology。

高效分析痕量降解微生物組的2bRAD-M技術

　　IIB型限制性內切酶就如同二郎神手中的三尖兩刃戟，在微生物DNA上尋找核心識別位點并同時切割其兩側翼序列【對應“三尖兩刃”】，從而產生大量等長短標簽，通過擴增、測序及相關算法計算，可對痕量、高度降解、嚴重污染的菌群樣本進行種水平的細菌、古菌和真菌鑒定

　　在微生物組研究中，解析微生物群落的物種構成主要依賴于兩種高通量手段：擴增子測序（16S/18S/ITS）和鳥槍法宏基因組測序（WMS）。然而目前這兩種主流手段都面臨著關鍵瓶頸。擴增子測序存在擴增偏好性、脫靶擴增、物種分辨率低等問題，且通常無法同時檢測細菌、古菌與真菌。鳥槍法測序雖然一定程度上解決了上述問題，但對樣本DNA質和量的要求高，故通常難以分析痕量、高度降解或污染嚴重的樣品，而且測序成本相對很高。因此，亟待開發一種高物種分辨率、高靈敏性、可同時鑒定所有原核與真核微生物、不懼樣品降解或污染、低成本的微生物組測序技術。

　　針對上述瓶頸，青島能源所單細胞中心孫政博士和黃適博士為核心骨干的研究小組，建立了名為2bRAD-M的 “簡化宏基因組測序技術”，有效克服了上述擴增子測序和鳥槍法測序的核心缺陷，有望作為一種共性的新手段，服務于人體與環境中痕量、高度降解或污染嚴重之菌群樣品的高效解析。

　　IIB型限制性內切酶，是一種能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并在識別位點上游和下游的特定距離進行切割，形成等長短片段（20-33 bp）的核酸內切酶。作為一種基于IIB型限制性內切酶特性的測序技術，2bRAD目前已經被應用于包括人體、模式動物、海洋動物等上百個單一物種的基因組研究。但一個菌群通常由成百上千個真菌、細菌和古菌物種組成，比分析單一物種復雜得多。

　　研究人員提出了2bRAD-M技術的原理：處理菌群總DNA樣本，對IIB酶切片段進行擴增和測序，然后以各種微生物基因組序列上的理論酶切位點為參照，來推斷菌群結構。為了驗證該技術，該研究首先通過模擬酶切數據，研究了不同來源、相似度或復雜程度以及不同實驗方法學對菌群定性和定量分析的影響，并解決了高重復性短片段DNA干擾序列匹配的問題。其次，通過利用人工和自然菌群樣本，驗證了2bRAD-M的敏感性、重復性、分辨率、準確度和偏好性等，進而挖掘了該方法用于各種實際菌群樣品之測序的潛力和局限性。

　　具體來說，研究人員證明，該技術能夠有效處理低生物量菌群樣本，例如，針對總DNA僅為1 pg、長度僅有50 bp的高度片段化、或99%被宿主DNA污染的人工菌群DNA樣本，2bRAD-M均能得到種水平、高度準確、同時涵蓋細菌、古菌和真菌的菌群結構的定性與定量分析結果。針對皮膚，腸道和環境等實際樣本，2bRAD-M同樣表現出色。針對臨床最常見、但菌群DNA極為微量且高度降解或污染的福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣本，該研究發現，僅用極微量的FFPE切片樣本（3 cm 2 m），2bRAD-M就能捕捉到潛在可服務宮頸癌診斷的微生物物種標識物。這些發現，對于腫瘤微生物組、免疫組織微生物組等基礎醫學研究與臨床實踐，具有重要的方法學意義。

　　該工作由單細胞中心徐健研究員與中國海洋大學王師教授主持完成，青島歐易生物深度參與了技術研發并提供了重要技術支持，獲得了國家自然科學基金、國家重點研發計劃、中國博士后科學基金、山東省人才工程項目的資助，并得到寶潔公司的技術支持。 

　　原文鏈接：https://doi.org/10.1186/s13059-021-02576-9

　　Zheng Sun#, Shi Huang*#, Pengfei Zhu, Lam Tzehau, Helen Zhao, Jia Lv, Rongchao Zhang, Lisha Zhou, Qianya Niu, Xiuping Wang, Meng Zhang, Gongchao Jing, Zhenmin Bao, Jiquan Liu, Shi Wang*, Jian Xu*. Species-resolved sequencing of low-biomass or degraded microbiomes using 2bRAD-M. Genome Biology, 2022, 23:36.