近日，實驗海洋生物學重點實驗室張琳琳團隊在牡蠣基因組編輯方面獲新進展，相關成果在學術期刊Frontiers in Marine Science發表。  

　　隨著對高品質動物蛋白需求的迅速增長，水產養殖正成為人類食用海產品的主要來源。然而，與許多成熟的陸生牲畜和作物系統相比，大多數水產養殖物種育種仍處于馴化的早期階段。傳統的育種方式，如選擇、雜交和標記輔助育種系統，已經推進了水產養殖物種經濟性狀（包括抗病性、營養價值和生長質量等）的遺傳改良?；蚪M編輯技術是近年來研究基因功能和解析性狀最直接有效的方法，其中CRISPR/Cas9基因編輯技術因具有操作簡單、靶點選擇廣、成本低、效率高等優點，為重要水產物種經濟性狀的遺傳解析和良種培育提供了最直接有力的工具。

　　牡蠣為世界大宗水產養殖貝類，但和水產魚類相比，基因組編輯育種技術在牡蠣中應用還處于起步階段。針對牡蠣卵徑?。▇50 m）、顯微操作難、幼蟲死亡率高、間接發育時間時間長以及在獲得可遺傳純系方面難度大、成本高、耗時長的難題，中科院海洋所張琳琳研究團隊經過長期的研究攻關，搭建了一套基于電穿孔的Cas9/sgRNA復合物高通量遞送和突變體快速檢測的技術平臺，成功實現了對牡蠣（Crassostrea gigas angulate）基因組中標記基因（ -tubulin）的高效編輯。 

基于電穿孔的CRISPR/Cas9基因編輯系統和突變表型快速檢測平臺示意圖 

　　研究采用作者前期研發的“長片段缺失鑲嵌性突變技術”(Zhang L., et al, 2016, Nature Communications; Zhang L., et al., 2017, PNAS)。通過同時電穿孔多個靶基因sgRNAs，研究人員在長牡蠣靶向基因中檢測到超過300 bp的長片段缺失突變，這使得研究人員可以使用PCR和常規瓊脂糖凝膠電泳對突變體進行快速篩選和基因分型。這種同時傳遞兩個以上sgRNAs以獲得長片段缺失的策略是一個顯著的改進，大大簡化了基因組編輯基因型檢測的工作流程。此外，利用原位雜交和行為學分析等表型檢測手段，研究人員在牡蠣G0代幼蟲中觀察到了表型的鑲嵌型突變（纖毛的縮短、缺失）和運動能力下降。這種鑲嵌型突變有利于研究人員在G0代個體中對突變表型進行快速的鑒別，同時也能規避目標基因完全缺失導致的胚胎致死性。該研究在海洋經濟貝類牡蠣中建立了基于電穿孔和長片段缺失鑲嵌性突變的CRISPR/Cas9基因編輯平臺，可為今后基于CRISPR/Cas9基因組編輯技術在海洋貝類中開展基因功能研究提供有益的參考，同時也為牡蠣以及其他水產養殖物種的基因組編輯育種提供有力的工具。 

CRISPR/Cas9系統介導的長牡蠣 -tubulin基因的長片段缺失

CRISPR/Cas9系統介導的長牡蠣鑲嵌型突變的纖毛表型 

　　海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室博士后產久林和碩士研究生張韋為論文的共同第一作者，張琳琳研究員為通訊作者，實驗海洋生物學重點實驗室科研助理許悅、研究生薛雨、吳富村副研究員、張國范研究員和李莉研究員參與了該項目。研究得到了山東省“海洋生命資源綠色發展技術與應用”工作站，中科院先導專項B和國家海外引才計劃青年項目等項目的資助。 

　　相關成果如下： 

　　1.Chan, J.#, Zhang, W.#, Xu, Y., Xue, Y. & Zhang, L.* (2022). Electroporation-based CRISPR/Cas9 mosaic mutagenesis of -tubulin in the cultured oyster. Frontiers in Marine Science, 9: 912409. doi: 10.3389/fmars.2022.912409. 

　　2.張琳琳，許悅，張韋，產久林?？焖佾@得基因型和表型突變的CRISPR/Cas9基因敲除方法及應用，專利申請號202210378237.8。 

　　3.張琳琳，張韋，許悅，產久林。長牡蠣 -tubulin基因的電穿孔基因編輯方法及應用，專利申請號202210378335.1。 

　　4.張琳琳，許悅，吳富村。一種皺紋盤鮑CRISPR/Cas9基因編輯的方法，專利申請號202111053880.5。 

　　5.Zhang, L., Mazo-Vargas, A. & Reed R.* (2017). A single master regulatory gene coordinates the evolution and development of butterfly color and iridescence. Proceedings of the National Academy of the USA, 114(40):10707-12. 

　　6.Zhang, L. & Reed R.D.* (2016). Genome editing in butterflies reveals that spalt promotes and Distal-less represses eyespot colour patterns. Nature Communications, 7, 11769.